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植酸酶的耐熱性
植酸酶作為飼料添加劑，主要用于提高單胃動物對飼料中植酸磷等物質的利用率，降低磷的排放量，已經獲得了廣泛的認可。但在推廣應用中還存在一些問題，較為突出的是植酸酶的熱穩定性問題。飼料生產的制粒過程需要經過高溫加熱，一般在75℃～80℃，同時為了殺死沙門氏菌，有時溫度高達90℃～95℃，植酸酶在這樣的溫度下很容易失去部分活力，甚至完全失活。在中國，顆粒飼料約占飼料總產量的70%，所以獲得高熱穩定性的植酸酶是近年來植酸酶工業的研究熱點和難點。
現有的部分植酸酶的最適溫度和熱穩定性見表1。植酸酶制劑的熱穩定性與植酸酶本身的熱穩定性密切相關，但大部分熱穩定性好的植酸酶的最適酶促反應溫度也偏高，而最適酶促溫度接近40℃的植酸酶則熱穩定性較差，所以目前的研究工作是尋找更高耐熱性且最適酶促溫度接近40℃的優質植酸酶，以促進植酸酶的普遍推廣使用。
表1 部分植酸酶的最適溫度及熱穩定性
表1 部分植酸酶的最適溫度及熱穩定性
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來源 |
最適溫度 |
熱穩定性 |
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A . ficuum2NRRL3135 |
58℃ |
在沒有穩定劑存在的條件下，最高可以耐受65℃的高溫 |
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Aspergillus f umigatus |
70℃ |
100℃下加熱20min后，酶活僅損失10% |
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A . niger N25 |
60℃ |
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Aspergillus Oryzae M105 |
56℃ |
65℃時酶活性喪失80% |
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Thermomyces lanuginosus |
65℃ |
熱變性溫度75℃ |
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Penicillium Canescens |
60℃ |
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Bacillus Subtilis |
55℃ |
60℃1小時，活性減少90%；60℃2小時，活性全部喪失 |
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玉米Zea mays |
55℃ |
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番茄 |
45℃ |
50℃以下，活性保留80%；60℃以下，活性很快喪失 |
酶對溫度的敏感性不但與酶蛋白分子本身的結構有關，也與酶的濃度、純度、有無底物和保護劑的存在、介質的pH值、離子強度等一系列條件有關。提高植酸酶熱穩定性的主要途徑就是從這些方面入手的。
一、改變植酸酶分子結構提高耐熱性
1、酶分子的生物修飾——糖基化修飾
真核生物的蛋白質合成有復雜的翻譯后修飾過程，對蛋白質產物的性能有重要作用。由于翻譯后修飾的細微差異，同菌種同基因，不同分離菌株中表達產物的性質也會出現一些差異。
翻譯后修飾中最主要的是糖基化修飾。糖基化修飾一般會提高重組酶的分子量，最佳酶促反應溫度變化很小，但可以大幅度提高該酶的熱穩定性。例如，設計新的表達載體使phyA基因在Saccharomyces cerevisiae中表達，由于S . cerevisiae表達系統的高度糖基化作用，重組酶的分子量達到120kD，比天然表達的phyA的分子量大50% 。重組酶的最適酶促反應溫度55℃～60℃，比原酶的范圍更寬，未完全純化的重組酶在55℃與80℃下分別作用15min之后，酶活分別保留95%和75% ，而同樣條件作用后的商品酶PhyA酶活保留分別為72 %和51% 。該重組phyA經去糖基化后，分子量變為50kD，酶活只降低了9%，但酶的熱穩定性大為降低，80℃加熱15min，酶活損失40%。該例說明糖基化程度對該酶熱穩定性的重要影響。
2、定點突變技術
Rodriguez等對E. coli pH215 酸性磷酸酶進行定點突變，用天冬氨酸替代酶蛋白多肽鏈中的幾個氨基酸殘基，增加酶分子潛在的糖基化位點的數目。突變體基因在P. pastoris 中表達，得到了糖基化程度、酶活性及熱穩定性改變很大的突變體植酸酶。近年來的研究也表明，單一氨基酸的替換可以改變酶蛋白的熱穩定性，尤其是Pro殘基對改善熱穩定性的作用尤為顯著，可以作為植酸酶蛋白改造的一個思路。
3、一致性技術
“一致性技術(consensus technique)”用于創造新的植酸酶分子。其方法是將已知的PhyA的氨基酸序列放在一起比較，借助計算機的幫助，從中選擇對每一個氨基酸位點最保守的殘基，拼成序列，然后將最后確定的氨基酸序列翻譯成相應的DNA序列，再選用合適的表達系統對這個“人造的”目的基因進行表達。
2002年，Lehmann等在13個植酸酶序列的基礎上，增加6個植酸酶的序列進行一致性技術構造，得到的新酶phyA210比以前得到的phyA21的熱穩定性提高了7.4℃。對phyA210中4個不穩定性氨基酸進行回復突變，并且引入一個新的穩定性氨基酸殘基，使phyA210的熱穩定性從85.4℃進一步提高到90.4 ℃。通過定點突變逐個檢測每個氨基酸殘基對熱穩定性提高的貢獻，結果發現交換的38個殘基中每一個氨基酸殘基單獨對熱穩定性的貢獻都小于3℃，整體上熱穩定性的提高是這些對該蛋白有穩定作用的氨基酸共同作用的結果。
4、替換二級結構
Jermutus等按照耐熱性niger植酸酶的晶體結構，將Aspergillus A . terreus 植酸酶表面的一個二級結構α-螺旋用A .niger 植酸酶上相應長度的一段序列替換，獲得了酶活性未變而熱穩定性提高的新植酸酶。盡管新酶中只有A . niger 植酸酶31個氨基酸序列，但新酶的熱穩定性與A . niger 植酸酶相似。說明這種熱穩定性一定程度上是該二級結構作用的結果。相對于隨機突變的大量篩選而言，該方法省去了篩選的繁重工作。
二、改變植酸酶的環境條件提高植酸酶的耐熱性
1、植酸酶的固定化
固定化酶廣泛應用于生產和研究領域，可以大大提高酶的穩定性。已有研究人員在嘗試植酸酶的固定化應用，用來制備肌醇多磷酸的系列化合物。以植酸酶為標志酶，還發展出了通用于真菌來源的酶的新的固定化技術。固定化植酸酶的穩定性和重復利用性大為提高，是植酸酶利用的方向之一。
2、緩沖液和保護劑
在熱處理中所使用的緩沖液可以調節酶的熱穩定性。重組表達的A . f umigatus 植酸酶經高溫處理后，在10mmol/L和200mmol/L的醋酸鈉溶液中比在檸檬酸溶液中的殘留酶活性可以高20%～39%。另外，保護劑的添加也會大大增加酶的熱穩定性，例如甘油、蔗糖、乙二醇溶液和無機鹽類等
3、包衣技術
將成型后的顆粒植酸酶采用包衣劑，在表面形成一層堅固的薄膜，使植酸酶顆粒與外界隔離，避免制粒時的濕熱條件破壞植酸酶分子結構，使植酸酶活性降低或完全失活。該薄膜要求在胃液中溶解釋放出植酸酶分子。若使用多種包衣劑，通過多次包衣形成多層薄膜，會進一步提高植酸酶的熱穩定性。
三、植酸酶耐熱性的評價
關于植酸酶產品耐溫性評價方法，基本是四種方法。馮定遠等(2008)研究結果表明，濕熱法與實際調質制粒對植酸酶處理結果具有最強的相關關系（r=0.97），濕熱法是最適宜的快捷評價植酸酶耐熱性的實驗室方法。該文獻評價方法總結見下表：
表2 植酸酶產品耐溫性評定方法
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方法 |
耐熱條件 |
溫度℃ |
與實際制粒相關系數r |
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緩沖液水浴法 |
吐溫20乙酸緩沖液水浴10分鐘 |
70、80、90 |
-0.62 |
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干熱法 |
恒溫烘箱熱空氣加熱10分鐘 |
70、80、90 |
0.09 |
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濕熱法 |
補水到16%恒溫烘箱熱空氣加熱10分鐘 |
70、80、90 |
0.97 |
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實際制粒 |
實際調質后制粒 |
80 |
由于恒溫烘箱的不同高度、不同位置溫度差達到2～3℃，試驗結果平行誤差較大。水浴鍋中不同位置的溫度差一般不超過0.1～0.2℃，同時目前實際制粒一般調質水分到18%，所以我們采用將待測植酸酶樣品補加水分到18%后用鋁箔袋密封，采用水浴加熱到待測溫度，所得到的結果平行誤差較小。由于相同溫度下，水浴熱量傳遞速度和強度遠遠高于熱空氣氣浴熱量傳遞速度和強度，即使水浴5分鐘，對植酸酶活性破壞力也遠大于熱空氣氣浴10分鐘。
所以，我們將濕熱法調整為補充水分到18%，鋁箔袋密封后，在待測溫度下水浴加熱5分鐘。該方法評價植酸酶熱穩定性更加合理。
四、昕大洋公司植酸酶產品的熱穩定性
通過多年大量的研發工作，通過基因重組、糖基化修飾、固定化技術和復合包衣技術等一系列技術的應用，北京昕大洋科技發展有限公司植酸酶的熱穩定性獲得了重大突破，新型耐高溫植酸酶顆粒產品95℃濕熱法酶活存留率達到90%以上，甚至100℃濕熱法酶活存留率也可以達到70%以上，該技術居于行業先進水平。
五、未來發展趨勢
雖然在提高植酸酶的熱穩定性方面已經取得了很大的進步，但植酸酶的應用研究并非僅限于熱穩定性，提高酶的綜合性能才是今后發展的關鍵所在。人們在提高植酸酶的活性，增加它對蛋白酶的抵抗性，獲得最適宜的pH性質等方面也已經做了很多工作，并取得了豐碩的成果，今后在這些方面一定會有更多突破，使植酸酶有更廣泛的應用。
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